4: Escape from macrophages aviaires par vomocytosis (a) Quantification de vomocytosis sur 24 heures de la microscopie laps de temps.. Les données poolées de n = 3 répétitions expérimentales. (B) Exemple de vomocytosis à 42C du film supplémentaire S2 en ligne. La flèche indique la cellule cryptococcose. (C) Exemple d'événement unique vomocytic à 37C du film supplémentaire S3 en ligne. Les flèches indiquent cryptocoques avant et après vomocytosis. (D) Exemple de grande vomocytosis vacuole à 37C du film supplémentaire S4 en ligne. La flèche indique ébouriffant de macrophage pseudopode après vomocytosis montrant que la cellule est entièrement viable après l'expulsion. Echelle barres 10m.

Mammifères

suppriment la croissance intracellulaire de cryptococciGiven l'importance du parasitisme macrophage dans l'infection à Cryptococcus mammifères, nous avons établi un modèle de macrophage aviaire primaire pour enquêter sur Cryptococcus virulence chez les oiseaux. Pour ce faire, nous avons généré une population hautement purifiée primaire, dérivé des monocytes, des macrophages provenant du sang périphérique de poulet (fig. 1a). l'isolement de poste Un jour, les cellules adhérentes ont une population mixte de monocytes et hétérophiles (Fig. 1b). Après 48heures hétérophiles ont été perdues et dérivées de monocytes macrophages (mDMS) sont restés (Fig. 1c). macrophages aviaires efficacement à la fois phagocytées perles cryptococcose et de latex de même diamètre (Fig. 1d, e).

Figure 5: Augmentation de la taille de la cellule reconstitue la prolifération d'un sous-ensemble de cryptococcose dans les macrophages aviaires à 42 ° C (a) Exemple d'augmentation de la taille des cellules et la prolifération des cellules de la faible proportion de cryptococcose intracellulaire.. Contraste de phase de microscopie laps de temps. Barre d'échelle 5m. (B) Quantification de diamètre des cellules cryptococcose au cours des phases d'élargissement et en herbe. Plage normale du diamètre des cellules cryptococcose est 3 5m. Même cellule, comme indiqué en (a). (C) de diamètre cellulaire de cryptocoques intracellulaire à 0 et 24hpp de n = 3 expériences à 37C et 42C. (D) Augmentation de la taille de la cellule cryptococcose extracellulaire en réponse à la température. diamètre de cellule de cryptocoques extracellulaire à 0 et 24hpp de n = 3 expériences à 37C et 42C. (E) d'un diamètre de cellule de cryptocoques vivants et morts. Box parcelles dessinées avec la ligne médiane =, boîte = intervalle interquartile, bar = 5 à 95%, points = valeur aberrante. Les mesures ont été effectuées à des moments identiques 1 heure avant la perte de fluorescence de la GFP de cellules mortes. Equivalent cellules vivantes a été choisi au hasard dans un même champ de vision. 80 cellules de n = 3 expériences. (F) graphique de la relation entre la taille de la cryptococcose cellulaire, la croissance, l'emplacement et la température. les rapports de nombre cryptococciques sont prises à partir des moyens tracés sur la Fig. 3a, e et le diamètre de la cellule sont des moyens de tracé de données en (c, d).

la croissance intracellulaire de

Figure

Nous avons identifié deux changements de taille des cellules cryptococciques distinctes lors de l'interaction avec les macrophages aviaires. La réduction de la taille de la cellule par rapport à la population initiale observée dans cryptocoques intracellulaire à 37C a démontré la détection d'un manque de ressources en nutriments, ce qui entraîne le taux de croissance faible et petite size30 cellulaire. En revanche, cryptococcose extracellulaire n'a montré aucune différence dans la taille des cellules, et un bon taux de croissance à 37 ° C. Très peu de prolifération produite intracellulairement au 42C, mais ces cellules ne prolifèrent d'abord augmenté de manière significative la taille de leur cellule (6% de la population intracellulaire, a rassemblé des données à partir de 131 macrophages infectés de n = 3 expériences). Cette augmentation de la taille était plus petite que celle présentée par le titan / cellules cryptococciques géants trouvés pendant infections31,32 mammifères, mais est plus semblable aux changements observés dans les cellules mutantes dépourvues activité phospholipase b1 (de plb1) dans macrophages33 mammifères. Ces changements démographiques sous sont également semblables à la «division du travail» phénotype décrit pour C. gattii34. En accord avec nos données augmentation de la taille de la cellule semble être motivée par l'adaptation à l'hôte stress31.

Contrairement aux macrophages de mammifères, la prolifération intracellulaire de cryptocoques dans les macrophages aviaires était extrêmement rare. Au lieu de cela cryptococcose intracellulaire est apparu inerte (fig. 2a) ou ont été tués (observé par l'intermédiaire d'une perte de signal de la GFP cytoplasmique (Fig. 2b), qui est indépendant de toute photoblanchiment (fig. 2c)). La perte du signal de la GFP a eu lieu à la dégradation et à la dispersion de polysaccharide capsule (Fig. 2d) et après la digestion des cellules fongiques (Fig. 2e).

Figure

de monocytes MacrophagesChicken primaire Poulet monocytes dérivés ont été isolés à partir du sang périphérique de poulet (Firstlink, Birmingham, Royaume-Uni). Le sang a été dilué 1: 1 avec du PBS stérile, en couche sur une plaque de Ficoll Plus (GE Healthcare, Vienne) coussin en un rapport de 1: 1 et centrifugés à 285g pendant 30 minutes en l'absence de freinage. Les cellules ont été récoltées à partir de l'interface de Ficoll, dilué 1: 1 avec du PBS stérile et centrifugées à 200xg pendant 5 minutes, lavées une fois dans du PBS et remises en suspension dans du RPMI avec du sérum de 5% de poulet, 50U / ml de pénicilline et 50 g / ml de streptomycine. La suspension cellulaire a été diluée à 1106 cellules par ml et 20 ml plaqué par 75cm2 flacon de culture tissulaire à 42 ° C dans une atmosphère humidifiée de 5% de CO2. Après 24heures cellules non adhérentes ont été removed. cellules adhérentes Jour 1 message d'isolement étaient une population mixte de monocytes et hétérophiles (Fig. 1b). Après 48 heures adhèrent

macrophages ResultsAvian

Figure

sont généralement incapables de supporter des températures de base 42C pendant des périodes prolongées. Néanmoins, nous avons testé la capacité de Cryptococcus à croître dans les macrophages murins ci-dessus 37C. L'incubation des macrophages murins à 39C a vu une réduction importante du nombre de présents cryptocoques à 24 heures après la phagocytose mais à 42C zéro cryptocoques étaient présents (Fig. 3f). Cependant, le nombre de macrophages murins ont été réduits de manière significative à 39C, et complètement ablater au 42C (fig. 3g), ce qui suggère que le nombre réduit de cryptocoques mesurées était due à la perte des macrophages de l'essai et non augmenté tuer cryptococcose, une perte qui ne se produit pas avec des cellules aviaires (fig. 3 H).

Figure

supérieur température Canada Goose Femme Sans Fourrure Femme de la cellule hôte entraîne augmentation de protection dans la cellule fongique analyse sizeCareful des expériences lapse de temps a montré qu'un petit sous-ensemble de cryptocoques intracellulaire est devenu agrandi, plutôt que de sortir via vomocytosis11 et cette augmentation de la taille des cellules était suffisante pour rétablir un certain niveau de capacité proliférative (6 % par rapport à 24 heures, a rassemblé des données à partir de 131 cellules de n = 3 expériences;. la figure 5a, b, voir supplémentaire Film S5 en ligne). Après 24 heures de croissance extracellulaire à 37 ° C, cryptococcose n'a montré aucun changement dans la taille de la cellule par rapport à la population initiale (figure 5c;. P = 0,12), tandis que la croissance intracellulaire dans des macrophages aviaires à 37 ° C a donné lieu à une réduction de la taille des cellules par rapport à la population initiale, (5d. Fig; P = 2,6106). En revanche, à la fois cryptocoques intracellulaire et extracellulaire a montré une augmentation significative de la taille plus 24 heures à 42C (Fig. 5c, d). Nous avons donc considéré que cette augmentation de la taille des cellules peut être protectrice, ce qui permet la survie des cryptocoques. À l'appui de cette hypothèse, la mesure de la taille des cellules cryptococcose à partir de points de temps identiques dans des expériences de déchéance de temps a démontré que des cellules plus grandes étaient significativement plus susceptibles de survivre dans les macrophages aviaires (Fig. 5E). Ainsi, la température élevée du corps aviaire est nécessaire pour le contrôle d'une infection à Cryptococcus innée, mais induit également une augmentation de la taille de protection des cellules fongiques qui permet à l'agent pathogène à persister (Fig. 5f).

En conclusion, la fonction phagocytaire effective des résultats plus élevés de la température corporelle aviaire dans la suppression presque totale de la prolifération cryptococcose dans les macrophages d'oiseaux. Cependant, une minorité de cryptocoques sont en mesure d'échapper à mort, soit par un élargissement de protection cellulaire ou via vomocytosis. sur le bec ou les griffes, est suffisante pour l'inoculation de guano et d'autres de l'environnement, nous sommes en mesure de démontrer que le transport interne est possible, et même probable, après toute ingestion de cryptocoques. infection cutanée), tandis que la maladie systémique est extrêmement rare.

cryptococcose dans les macrophages est une des caractéristiques décrites plus ancienne de la cryptococcose pathogenesis24 cellulaire humaine est en corrélation avec la maladie et est conservée dans de tels organismes aussi divers que les insectes et phagocytes25 amoebae26 sociale. Ce qui détermine alors la résistance des macrophages aviaires à la prolifération cryptococcose? Tolérance de température corporelle relativement élevée est le principal déterminant des infections fongiques chez des hôtes homéothermes et explique pourquoi si peu de champignons sont des agents pathogènes de mammals21. Cependant, Cryptococcus neoformans est une yeast27 remarquablement thermotolérants et ce thermotolérance est la caractéristique principale de la maladie causant des espèces cryptococciques, même en présence d'autres facteurs de virulence majeurs. La gamme de croissance maximale de Cryptococcus varie entre les souches et par l'environnement de croissance, mais montre un chevauchement important avec aviaire temperature28 du corps. En accord avec cela, nous montrons que Cryptococcus est capable de croître à 42C dans une niche extracellulaire. Cependant, cryptocoques étaient incapables de se développer de manière intracellulaire dans les macrophages aviaires, et le déplacement des macrophages aviaires pour abaisser les températures seul restauré la capacité proliférative intracellulaire de cryptocoques, démontrant ainsi la contribution essentielle de cette réponse immunitaire cellulaire innée à la suppression de la cryptococcose chez les oiseaux.

De manière remarquable, nous démontrons aussi que vomocytosis de cryptococcose intracellulaire se produit dans les macrophages aviaires d'une manière qui ne peut être distinguée de vomocytosis de mammifère soit dans la morphologie ou la fréquence. En outre, ce processus semble pas être affecté par la température de la cellule aviaire et quand la prolifération est sévèrement restreint. La cause et la fonction de vomocytosis lors de l'infection des animaux est encore incertain, mais vomocytosis offre un net avantage dans la prévention de la prédation par le sol amibes predators29 et ces données confirment l'importance fondamentale et la conservation de ce phénomène inhabituel.

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Culture et de la souche infectionCryptococcal H99GFP23 a été cultivée pendant 18 heures dans YPD (2% de glucose, 1% de peptone et 1% d'extrait de levure) tournant (20rpm) à 25 ° C. Les cellules de levure ont été sédimentées à partir de la culture par centrifugation (2 minutes, 4000g) et remises en suspension dans du PBS.

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3:. Température modulant parasitisme des macrophages aviaires par Cryptococcus (a) Nombre de cryptocoques dans les macrophages aviaires après 24 heures en tant que rapport à 0 heures poster phagocytose. échelle Identique (e), insérer des valeurs de prolifération panneau intracellulaires tracées à plus grande échelle. (B, c, d) Cryptococcus prolifération intracellulaire dans les macrophages aviaires à 37C (b) les événements en herbe individuels séquentiels de cellule mère seule dans les macrophages aviaires à 37C. Flèche, cellule mère. Flèche têtes, les cellules filles. (C) L'élargissement de cellules à partir fléchés (b). (D) de la prolifération intracellulaire Massive sur 15 heures à 37 ° C. Echelle barres 10m. (E) Nombre de cryptocoques de plus en plus après 24 heures extracellulaire comme un rapport à 0 heures. Les valeurs de P pour la comparaison de la croissance intracellulaire dans des macrophages aviaires (I) et de croissance extracellulaires (E): Intracellulaire (I) 37 et 42C n = 9; (I), n = 6 39C; Extracellulaires (E) n = 3. Par rapport I37 I39 P = 5,6103; I37 I42 par rapport à P = 3,5104; I37 vs E42 P = 1,5103. I39 vs, I42 P = 1,3102; I42 vs. E42 P = 1,3103; E37 vs E42 P = 4,9102; E39 vs E42 P = 4,9102. (F) Nombre de cryptocoques dans les macrophages murins après 24 heures en tant que rapport à 0 heures après la phagocytose. (G) Nombre de macrophages murins après 24 heures en tant que rapport à 0 heures poster phagocytose de cryptocoques. (H) Nombre de macrophages aviaires après 24 heures en tant que rapport à 0 heures poster phagocytose de cryptocoques. Les barres d'erreur écart type de la moyenne.

1:. L'isolement et la caractérisation des monocytes macrophages dérivés du sang périphérique de poulet (a) tracé représentatif de la population de cellules isolées à partir du sang périphérique de poulet marqué avec monocytes / marqueur macrophage (KUL01; non rempli) par rapport à isotype étiquetage de commande (rempli). (B) les cellules adhérentes isolé isolement post 1 jour (dpi). m, monocytes et h, heterophil. Barre d'échelle 20m. (C) monocytes macrophages dérivé 3 jours après l'isolement. Barre d'échelle 20m. (D) Phagocytose de billes de latex rouges fluorescents mesurés par cytométrie en flux. (E) phagocytose des H99GFP cryptocoques mesurée par cytométrie en flux. macrophages du panneau gauche seule, les macrophages du panneau de droite, plus H99GFP. points gris représentent les cellules contenant cryptocoques (points noirs représentent les macrophages sans cryptocoques intracellulaire).

Isolation

Vomocytosis est conservé comme un mécanisme d'évasion pour Cryptococcus dans les macrophages aviaires indépendamment du succès parasitismVomocytosis est l'évasion non lytique de Cryptococcus de cells8,10 hôte. Compte tenu du défaut grave dans Cryptococcus parasitisme des cellules hôtes aviaires dans les macrophages, nous émettons l'hypothèse que vomocytosis serait affectée de façon similaire. Cependant, cryptocoques ont été efficacement vomocytosed des macrophages aviaires à 42C et à une fréquence comparable à celle mesurée en macrophages23 mammifère à 37C (Fig. 4a, b et complémentaire Film S2 en ligne). De même, l'incidence des vomocytosis n'a pas été affectée par déplacement des macrophages aviaires à 37C (Fig. 4a) en dépit d'un changement radical dans phagosome morphologie qui a abouti à une combinaison de multiples seule expulsion events8 (Fig. 4c et complémentaire Film S3 en ligne) et vacuole massif exit10 (Fig. 4d et complémentaire Film S4 en ligne). Pris ensemble, ces données démontrent que les deux vomocytosis est conservée chez les oiseaux et que cryptococcose peut échapper à des cellules hôtes dans des conditions défavorables.

IntroductionCryptococcus neoformans est un champignon de l'environnement qui provoque la maladie humaine et animale fatale. Chez l'homme, la cryptococcose provoque des centaines de milliers de morts chaque année, la grande majorité dans patients1 immunodéprimés. Comme avec de nombreux agents pathogènes importants, cryptococcose sont capables de parasiter les cellules hôtes. Ce potentiel pour un mode de vie intracellulaire permet C. neoformans le potentiel de se soustraire à des réponses immunitaires de l'hôte supplémentaire et donc se propager dans le corps, conduisant à disease2,3 systémique.

Cryptococcus a remarquablement large gamme d'hôtes, mais avec une variation significative de la sensibilité entre les espèces à la fois infection4 naturelle et induite expérimentalement. Les oiseaux sont particulièrement résistants à la maladie, en dépit des ordres aviaires divers (Passeriformes, Anseriformes, Accipitriformes, Apterygiformes, Psittaciformes et Columbiformes) montrant association environnementale claire avec Cryptococcus et la capacité de transmettre l'agent pathogène à humans5,6,7,8,9,10, 11. bec et griffes, mais aussi le transport interne suite à l'ingestion de matière végétale contaminée ou tout feeding12,13,14,15,16,17 au sol. Oiseau guano est un excellent milieu de croissance pour Cryptococcus et transport externe de cryptocoques par les oiseaux est une voie probable pour l'inoculation avec la dispersion de l'air des spores. Toutefois, si cryptocoques sont capables de survivre au passage dans les oiseaux ce serait fournir une voie directe pour l'inoculation. exposition des individus immunodéprimés aux pigeons urbains et guano) et pour la dispersion globale de lineages18,19,20 fongique spécifique. Le mécanisme sous-jacent de la résistance aviaire à cryptococcose est inconnue, mais a été émise à dépendre du plus temperature21 du corps. Ici, nous testons cette hypothèse directement et montrent, de manière surprenante, que la haute température du corps seul est insuffisant pour empêcher la croissance cryptococcose. Cependant, aux températures du corps aviaires, les macrophages d'oiseaux suppriment fortement la croissance fongique mais une faible proportion de la population de cellules fongiques échapper à mort. Ainsi, nous proposons un modèle dans lequel les oiseaux peuvent abriter un faible nombre de cryptocoques pendant des périodes prolongées sans maladie et sont donc en mesure d'agir en tant que vecteurs de longue portée chariot fongique et sont capables d'inoculer directement guano22.

Matériaux et MethodsCryptococcus

température corporelle aviaire est nécessaire mais pas suffisante pour empêcher growthQuantitation cryptococcose de viable intracellulaire de levure 24 heures après phagocytose confirmé nos données lapse de temps, ce qui indique qu'il y avait une réduction de plus de 80% du nombre de cryptocoques dans les macrophages aviaires à une température corporelle des oiseaux typiques de 42 ° C (Fig. 3a). Cependant, un changement de température de 42C à 39C a abouti à une restauration du nombre de cryptocoques et le passage à 37C rétabli la capacité de cryptocoques à proliférer dans les macrophages (Fig. 3a et voir supplémentaire Film S1 en ligne). cryptocoques en herbe pourrait être clairement observé dans les macrophages aviaires à 37C par microscopie (Fig. 3b, c), avec 70% des macrophages présentant de grandes phagosomes contenant de nombreux cryptocoques après 24 heures (Fig. 3d). la croissance dans les médias de macrophage). Nous avons constaté que, tandis que le nombre de cryptocoques a été similaire modulée par la température, il y avait encore une augmentation du nombre cryptococciques sur 24 heures à 42C, contrairement à la réduction de 80% (Fig. 3e) à la même température dans les macrophages d'oiseaux. Ainsi seule la température ne peut pas expliquer cette restriction de la croissance cryptococcose, mais plutôt l'activité accrue des macrophages aviaires à la température du corps d'oiseau de 42C degrés est responsable pour prévenir l'expansion de la population pathogène intracellulaire.

Cryptococcus neoformans thermotolérance à Avian température corporelle est suffisante pour la croissance extracellulaires mais pas intracellulaires survie dans Macrophages

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AbstractCryptococcus neoformans est un pathogène fongique mortelle des humains qui parasitises efficacement les macrophages. Les oiseaux peuvent être colonisées par cryptocoques et peuvent transmettre la cryptococcose à l'homme par inhalation des excréta d'oiseaux inoculée. Cependant, la colonisation des oiseaux semble se produire en l'absence d'une infection symptomatique. Ici, en utilisant une population pure de macrophages d'oiseaux primaires, nous démontrons un mécanisme pour cette relation. Nous constatons que les macrophages d'oiseaux sont capables de supprimer la croissance de cryptocoques observée dans les cellules de mammifères en dépit C. neoformans étant capables de se développer à la température corporelle des oiseaux, et sont en mesure d'échapper à macrophages d'oiseaux par vomocytosis. Un petit sous-ensemble de cryptocoques sont en mesure d'adapter à l'environnement intracellulaire inhibitrice des macrophages d'oiseaux, présentant un grand phénotype cellulaire qui sauve la suppression de croissance. Ainsi, la restriction de la croissance intracellulaire combinée avec la survie à la température corporelle des oiseaux qui explique la capacité de se propager efficacement des oiseaux C. neoformans dans l'environnement, tout en évitant une maladie systémique.

2: Résistance des macrophages aviaires à Cryptococcus par le parasitisme (a) L'absence de prolifération intracellulaire cryptococcose dans les macrophages aviaires.. Phase contraste et fluorescent Vidéomicroscopie de la GFP intracellulaire exprimant la cryptococcose souche H99GFP. Images représentant de 50 cellules de n = 3 expériences. Barre d'échelle 10m. (B) de la destruction intracellulaire des cryptocoques dans macrophage aviaire primaire montré par la dégradation du signal GFP (vert) au fil du temps. Phase contraste et fluorescent Vidéomicroscopie de la GFP intracellulaire exprimant la cryptococcose souche H99GFP. Images représentant de 57 cellules de n = 3 expériences. Barre d'échelle 10m. (C) La perte de fluorescence de la GFP de l'un des deux cryptocoques intracellulaire. Phase contraste et fluorescent Vidéomicroscopie de la GFP intracellulaire exprimant la cryptococcose souche H99GFP sur 24 heures. (D, e) la dégradation de cryptococcose accompagne la perte du signal de GFP. (D) l'étiquetage immunofluorescence de polysaccharide capsulaire, un facteur de virulence cryptococcose, 0 et 3 heures poster phagocytose (HPP). La perte du signal de la GFP au 3hpp est associée à la dégradation de la capsule et de la production de vésicules macrophage contenant un polysaccharide capsulaire. contraste d'interférence différentiel (DIC) et la microscopie par fluorescence des cellules fixées. Barre d'échelle 5m. (E) Dégradation de cryptocoques intracellulaire suite à la perte de la GFP. Contraste de phase de microscopie laps de temps. Time = 0 indique une perte de signal de GFP visible. Barre d'échelle 5m.

DiscussionHere, nous montrons que les macrophages aviaires primaires, contrairement à ceux des mammifères, inhibent la croissance de l'agent pathogène fongique Cryptococcus neoformans fatales. aviaires macrophages seuls étaient capables de tuer la plupart des cryptococcose internalisé mais cette activité est dépendante de la température élevée du corps aviaire. macrophages de mammifères sont apparus pour supprimer de la même croissance de cryptocoques, mais se sont révélés être tué à 39C et 42C. Cryptococcose sont capables de s'échapper par l'intermédiaire des cellules aviaires vomocytosis et de répondre à la température plus élevée de l'hôte au moyen d'un élargissement de protection cellulaire. De telles méthodes de survie mettent en évidence le succès de Cryptococcus comme un pathogène opportuniste de l'environnement, qui peut exploiter un large éventail d'espèces hôtes.